第一節 細胞培養的必備設施
根據體外培養細胞生長特點和條件，擁有一個無菌實驗室、一臺超凈工作臺和一個恒溫培養箱是細胞培養的三大必備設施。
一、無菌實驗室
無菌實驗室或操作室的設計原則是，有防止微生物污染和有害因素的影響措施，要求工作環境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵。無菌實驗室最好能單獨設置。如果條件有限，只能限制在一個大實驗室內，應劃分不同的功能區或用鋁合金隔板隔開，將無菌操作室與清洗、消毒滅菌區、制備、儲藏和孵育區分開。
無菌操作區只限于細胞培養及其他無菌操作的區域。亦可把凈化工作臺置于操作室中，這樣更為安全。此室最好能與外界隔離，不能穿行或受其他因素干擾。操作室的大小依需要而定，一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時和幾個操作間相通。操作間放在內間，主要供無菌操作和細胞培養，房間應不受日光直射，大小適當，高度適宜(2.5m)。房間過大，清掃和消毒不便；過小，操作不便；頂部過高會影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應光滑無死角，以便清洗和消毒。工作臺不應緊靠墻壁放置，臺面漆成白色或灰色，以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。若能購置超凈工作臺則更好。無菌操作間應為密閉式，設置空氣消毒用的紫外線燈、空氣過濾凈化器和恒溫裝置。如果條件有限，僅做一般要求的細胞培養，在相對狹小的空間內，只設置凈化臺而不設操作室。但要注意季節氣候環境的影響和注意無菌操作環節。做要求較高的細胞培養，最好設置無菌操作室，有條件的應設凈化工作室，以避免季節影響和杜絕污染。
二、凈化工作臺
也稱超凈工作臺。目前大多數從事細胞培養工作的實驗室都已裝備了超凈工作臺。這種工作臺占據空間小，安裝方便，操作簡單，投資少，效果不比無菌操作室差，即使不設置單獨的無菌實驗室，只要購置安裝了超凈工作臺，也能進行簡單的細胞培養工作。
超凈工作臺種類繁多，但主要有三大類：一類是測流式；第二類為流直式；第三類為外流式，或稱為水平層流式。它們的基本工作原理大同小異：內設鼓風機，驅動空氣通過高效濾器過濾凈化后，讓凈化空氣徐徐通過臺面空間，使操作區構成無菌環境。它們的區別在于氣流的方向不同，側流式即凈化后氣流由左側或右側通過臺面流向對側；直流式為氣流從上向下或從下向上流動；外流式為氣流向操作者方向吹來。這三類工作臺各有利弊。側流式和直流式能形成氣流屏而保持操作臺無菌，但在凈化氣流和外界氣體交界處可因氣流的流動形成負壓，使少許未凈化氣體混入，有可能發生污染，尤其在多雨季節的南方，會增加污染機會。外流式工作臺因氣流面向操作者流動，外方氣流不易混入，但在做有害實驗時，對操作者健康不利。使用此類工作臺一般可用有機玻璃將上半部遮擋，讓氣流從下方通過，以盡量減少其不利影響。現在很多實驗室普遍使用的側流式工作臺,是一種封閉式的工作臺,兩個側面各留兩個圓洞，供操作者手臂伸入進行操作，污染機會極少。但要拿取較大物品或進行較大范圍的操作就不夠方便。
超凈工作臺作為一種設備也需要維護和保養，才能延長其使用壽命。一般應注意以下幾點：
（1）超凈工作臺一般宜安裝在避免日光直射、清潔無塵的房間內。若能放在無菌操作區內則更佳，不僅效果好，而且濾器（料）的使用壽命長。
（2）久未使用的工作臺在使用前應進行徹底清洗、消毒滅菌。用1:1000的來蘇兒或75%的酒精擦洗臺面，濾器械的灰塵可用真空吸塵器清除。停止使用時最好用作防塵布或塑料布套好，避免灰塵積聚。
（3）凈化工作臺內不應放置其他與細胞培養無關的用品，更不能用作儲存室。每次使用前半小時先開紫外線燈滅菌，再關滅菌燈啟動風機，然后進行培養操作。
（4）不設在無菌操作區內經常使用的凈化臺，要注意過濾器的效果。一般2~3年更換一次，3~6個月拆下清洗一次，以保持過濾器的凈化效果。
三、恒溫培養箱
用于細胞培養的培養箱分變通電熱恒溫培養箱和CO2培養箱。溫控變化一般不超過±0.5℃,最適溫度為37℃。因此要求培養箱具有較高的靈敏度。控溫裝置的優劣是電熱恒溫箱質量的關鍵，選購時一定要注意。一般選購隔水式或晶體管式控溫培養箱，適用于封閉式的培養。
CO2培養箱在細胞培養實驗室已得到普通的使用。它能提供較為恒定的CO2，通常為5%，使培養液的pH保持穩定，適用于開放式或半開放式的培養。需要注意的是：為了避免污染，要對培養箱定期進行消毒，如有紫外燈則用紫外線消毒，如無紫外燈須用酒精定期擦試消毒。另外，要維持箱內溫度、濕度的恒定，可用無菌蒸餾水定期注入外箱內，或用無菌潮濕的紗布置于托盤內，然后將培養皿、培養板置于上面，再放入CO2培養箱，以保持濕度，避免培養液蒸發而影響細胞生長。
四、其他設備
進行細胞培養除了上述三大設備外，還需配備電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學顯微鏡和倒置顯微鏡、細胞液氮儲存器、離心機、消毒器、抽濾裝置等。
電熱干燥箱：主要用于烘干熱消毒玻璃器皿，也可用于干熱消毒。在用于干熱消毒時，溫度一般要求達到160℃(滅菌)或180℃(去除熱原)，消毒時間須在2h以上。細胞培養實驗室常用的干燥箱為鼓風式電熱干燥箱（規格為5605 mm×500 mm×500mm），雖然升溫較慢，但溫度均勻，效果較好。鼓風與升溫同時開始，待溫度達100℃后再打開，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂損壞。金屬解剖器械、塑料制品、橡膠制品等不能放在干燥箱內滅菌。
冰箱：一般用雙門冰箱，既有4℃左右的冷藏區，又有-20℃以下的冷凍區。如條件許可，應有一臺普通冷藏冰箱和一臺低溫冰箱（<-70℃）。前者主要用于儲存培養液、生理鹽水、Hanks液、試劑等培養用的物品和短期保存的組織標本。后者用于保存需較長時間存放的制劑，如酶、血清和組織標本等。冰箱應保持清潔，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易揮發物品。
顯微鏡：應有一臺普通顯微鏡和一臺倒置顯微鏡。前者用于細胞計數和一般觀察，后者用于觀察細胞的生長情況和有無污染。若條件許可，應配置照相系統和熒光顯微鏡。
水純化裝置：這也是細胞培養不可缺少的設備。因為體外培養細胞對水的要求較高，無論是細胞培養液還是配試劑等都應使用兩次以上蒸餾的雙蒸水。離子交換裝置處理的水因為不能完全去除有機物而極少應用。外售蒸餾水常用金屬器蒸餾，易混入金屬離子，須用玻璃蒸餾器重新蒸餾一次后才能使用。目前國內普通使用的是自動雙重純水蒸餾器(碳管加熱)，較為安全、方便、蒸餾速度也較快，但不宜直接用自來水蒸餾。配制培養液的水應用配液前蒸餾的新鮮三蒸水。
細胞冷凍貯存器：主要是液氮容器。國產的能滿足要求。容積大小根據實驗室需求選購。一般小實驗室用35L3的，大實驗室，多可購50 L3的。窄頸瓶維持液氮時間長（1月左右），但存取不方便。寬頸瓶存取方便，但維持液氮時間短（7~10天）。定期加液氮的時間可據此來確定。由于液氮溫度達-196℃，使用時要防止凍傷手。
離心機：一般應配有普通離心機，最好應配置高速冷凍離心機。普通離心機轉速在4000r/min以下，臺式的就可滿足要求。用于制備細胞懸液、漂洗、分離細胞。若開展細胞脫核、DNA和RNA抽提、組織勻漿等研究，需使用高速、大容量和能進行調溫的離心機。
清毒器：一般常用小型手提式高壓蒸氣消毒器。它可用于無法干熱高溫烘烤消毒的各種塑料培養用品、橡膠制品等的消毒。
抽濾裝置：有Zeiss濾器、玻璃濾器和金屬濾器。濾器中的濾膜一般用0.2～0.3μm孔徑的微孔濾膜。凡在高溫或射線下易發生變性或失去功能的物質，如人工合成培養液、血清、消化用胰酶等都須用濾器過濾除菌。
第二節 細胞培養常用器材及處理方法
體外培養細胞使用的器材品種較多。由于離體細胞對各種毒物都很敏感，所以細胞培養所用器材的清洗、消毒處理是培養能否成功的關鍵之一。
一、玻璃器材
常用的玻璃器材有各種規格的玻璃瓶、培養瓶、培養皿、吸管、離心管等。
無論是初次使用還是培養后重復使用的玻璃器材均需要進行消毒處理。首次使用的玻璃器材應先用自來水初步刷洗，然后用稀鹽酸溶液（1%）浸泡過夜，再用自來水沖洗，最后處理方法與重復使用的器皿的處理。
重復使用的玻璃器皿的處理步驟：
（1）刷洗。用軟毛刷和優質中性洗滌劑刷洗，去除器皿內外表面的雜質。刷洗時注意不要用力過重，以防損壞器皿內表面光潔度，影響細胞生長；也不能留有死角。器皿數量大時，可使用超聲波清潔裝置，沖洗干凈后晾干。
（2）清潔液處理。將刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重鉻鉀清潔液中。清潔液配方如下，見表3-1：
表3-1 清 潔 液 配 方
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名 稱
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清 潔 液 濃 度
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25%(弱液)
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50%(次強液)
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75%(強液)
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重鉻酸鉀
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1000g
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1000g
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1000g
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濃 硫 酸
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2500mL
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5000mL
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7500ML
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蒸餾水(或廢液)
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7500Ml
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5000mL
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2500mL
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該清潔液具有高度腐蝕性，操作時必須穿長筒膠靴，戴防酸橡皮手套，圍裙和眼鏡，以防清潔液濺出而灼傷。在配液時還需注意將酸緩慢放入水中，以防酸遇水放熱產生酸濺出或使玻璃及陶制容器裂開而使清潔液外泄。切勿將水加入酸中，以防酸濺出。常用清潔液為75%和50%兩種。
將玻璃器皿放入時最好裝入塑料網袋內，再浸入清潔液中，玻璃瓶內不要殘留氣泡。一般浸泡12~24小時后取出。在清潔液中取出的器皿先用自來水沖洗10次以上，再用單蒸水沖洗三次以上，最后用雙蒸水（或去離子水）沖洗1~2次，晾干，包裝殺菌。一般用121℃磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。玻璃濾器使用后及時用自來水沖洗濾器表面的剩余物，然后用單蒸水浸泡，除去濾板內堵塞雜物，若用濾膜則將濾膜丟棄，加4N鹽酸浸泡12小時以上，用自來水沖洗，再用單蒸水抽濾2次，雙蒸水(或去離子水)抽濾沖洗、包裝、121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。也可用5%潔消精浸泡20分鐘后，再按上述方法沖洗和滅菌。
二、塑料器材
體外培養細胞中塑料器皿的使用越來越多，有進口的，也有國產的。主要有多孔培養板、培養皿、培養瓶及吸嘴。多孔培養板有4孔、6孔、24孔、96孔等規格可供選擇。多數為進口產品，已消毒滅菌密封包裝，使用時只需打開即可。
有一次性使用的，也有反復使用的。在我國不少實驗室，由于經費有限，經過清洗和消毒滅菌再使用的較多。
塑料器皿若使用后，先用自來水浸泡沖洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過夜，用自來水充分沖洗，或先用2%NaOH處理之后再用3%HCl浸泡30分鐘，最后用自來水沖洗干凈，并用雙蒸水沖洗3次以上，晾干。消毒采用紫外線直接照射或輻照滅菌辦法。清洗時要防止產生劃痕，以免影響細胞的貼附性。所以，培養要求較高的細胞的塑料器材，最好一次性使用。
三、橡皮器材
應選擇質軟、耐高溫、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各種瓶或試管的塞子、蓋子。新購置的橡皮制品，用自來水沖洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氫氧化鈉煮沸15分鐘，用自來水沖洗8次，再用4%鹽酸煮沸15分鐘，用自來水沖洗8次，單蒸水沖洗3次，雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或置于鋁盒內，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
已用過的橡皮制品，先用自來水沖洗干凈，然后用洗衣粉加熱煮沸10分鐘后，用自來水邊沖邊用力攪動，以充分洗凈殘余洗衣粉，然后用蒸餾水煮沸2次，每次15分鐘，再用單蒸水沖洗2次，必要時還要用雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或放于鋁盒內，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
四、金屬器材
細胞培養中需用多種金屬器材，用于解剖、取材、剪切組織及持取物件等，常用的有剪刀、鑷子、手術刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號針頭等。新的金屬器材，先用紙擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氫鈉煮沸15分鐘，擦干后再用95%酒精紗布擦干，包裝或置鋁盒內于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
已用過的金屬器材，及時用酒精棉球擦干凈，包裝入鋁盒內于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
五、其他物品
紗布先用自來水洗凈后，再用單蒸水沖洗，然后用單蒸水煮沸2次，每次15分鐘，并經常用長鑷子翻動，再用單蒸水洗2次，晾干后折成八層包裝，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
注射器的針頭使用后，立即用自來水（或來蘇爾水）沖洗數次，沖洗出針頭內的剩余物，以免堵塞針頭，然后用單蒸水洗2~3次，再用95%酒精沖洗3次，包裝或置鋁飯盒內121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
用于細胞培養過程中的各種人工合成培養液、緩沖液和酶濾液等也需要進行除(滅)菌處理。緩沖液常用高壓蒸氣消毒。血清用56℃水浴滅活30分鐘。人工合成培養液等酶溶液用過濾除菌。安裝濾器時要防止濾膜裝偏而導致過濾失效，過濾時力量不能過大、過猛，以免濾膜破裂。濾液量多，用抽濾式或加壓式（正壓式）過濾裝置。濾液量少，可選用2.5cm直徑的小號濾器，直接套在小瓶（如青霉素瓶）上，以注射器推動壓力過濾。
消毒滅菌前所用的包裝材料可用牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒和特制玻璃（或金屬）消毒筒等，可根據器材大小、形態選用，采取局部包裝或部分包裝，并用線繩扎緊。
第三節 常用溶液、培養液及其配制
體外細胞培養過程中使用溶液和培養液的好壞，直接影響到細胞的生長，配制時要十分注意。
一、平衡鹽溶液
平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細胞培養中常用的基本液體。它主要由無機鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調節酸堿度等重要作用。
(一)配液時的注意事項
（1）需用新鮮的三蒸水或去離子水，按規定的先后順序配制，稱量要準確，要看清藥品的規格、純度、結晶水的數量等，切勿搞錯。
（2）物質的純度 純度高的物質配制成的溶液質量高，因此在配液選用時要注意。常用的純度有優級純(特級純)，分析純（AR）和化學純（CD）三種類型。
（3）物質的可溶性 很多用于培養用液的化學物質都很難溶解，在配制時必須設法使其溶解。如磷酸鈣在堿性溶液中幾乎難于溶解，因此在制備磷酸緩沖液時，需將CaCl2及磷酸氫二鈉單溶后再混合，臨時用NaHCO3調pH至弱堿性，以避免沉淀析出。
（4）物質的不穩定性 不少物質性質不穩定，高溫高壓下易破壞。如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘，若超磅葡萄糖就會破壞。
5、貯存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時混合和稀釋，過濾除菌備用。
(二)幾種常用溶液的配制方法
1、無鈣、鎂、離子溶液(1000ml)
氯化鈉(NaCl) 8g 磷酸二氫鈉(NaH2PO4H20) 0.05g
氯化鉀(KCl) 0.2g 碳酸氫鈉(NaHCO3) 1g
檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g 葡萄糖 1g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
2、磷酸鹽緩沖液
甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液
磷酸氫二鈉(無水) 28.4g 氯化鈉 8.77g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
乙液：0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液
磷酸二氫鈉(無水) 2.4g 氯化鈉 8.77g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
甲、乙液于4℃保存，使用時按表3-2所示比例，配制成所需pH濃度，高壓滅菌后室溫保存。
表3-2 不同pH濃度所需甲液、乙液量 (mL)
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pH
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甲 液
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乙 液
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6.0
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12.5
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87.5
|
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6.2
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22
|
78
|
|
6.4
|
32
|
68
|
|
6.6
|
45
|
55
|
|
6.8
|
55
|
45
|
|
7.0
|
64
|
36
|
|
7.2
|
72
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28
|
|
7.4
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79
|
21
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3、Hanks液
(1)母液甲(20x)配法
① NaCl(A.R) 160g
KCl(A.R) 8g
MgSO4.7H2O（A.R) 2g
MgCl.6H2O(A.R) 2g
依次溶于800mL雙蒸水中，前一物質溶后再加后一種。
②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL雙蒸水中，溶時不斷攪拌（此液應單配，單溶）。
待上述兩溶液中的“溶質”全溶后，將它們混合，再用雙蒸水補至1000mL，向其中加2mL氯仿作為防腐劑，置4℃保存。
(2)母液乙(20×)配法
① Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g
KH2PO4(A.R) 1.20g
葡萄糖(A.R) 20.0g
溶于800ml雙蒸水中。
②0.4%酚紅液 0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01N NaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過濾，pH為7.4，4℃保存。
待上述各“溶質”完全溶解后，用雙蒸水補至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑，置40℃保存。
(3)使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝后，塞好瓶塞，掛上標志。以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞)，置室溫后4℃保存，可使用幾個月。臨用前，用7.5%NaHCO3調至所需pH。
二、其他溶液
1、pH調節液
(1)碳酸氫鈉液 可根據需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經過濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調節pH過程中或超過要求值時，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調節之。
(2)Hepes緩沖液 是一種可以保持細胞培養過程中pH值較長時間穩定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為10～15mmol/L。配制時，稱取所需的Hepes量，用培養液溶解，用1mmol/LNaOH調節pH至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4℃冰箱保存。
2、消化液
(1)胰蛋白酶溶液 它是一種黃白色粉末，易受潮，應密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細胞間的蛋白質水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落并使細胞游離分散開來。常用濃度為0.25%或5%。如5%胰蛋白酶溶液配制：
稱0.5g粉狀胰蛋白酶，溶于100mL無鈣鎂離子磷酸緩沖液中，置4℃過夜使其溶解，或將稱好的胰蛋白酶放入有刻度的燒杯中，先加入一半的磷酸緩沖液，在杯中放入一長短適宜、外周包有塑料或玻璃外殼的磁力棒，將燒杯放置在帶有控溫和控速的磁力攪拌器上，令磁棒勻速旋轉攪拌1-2小時后，胰蛋白酶充分溶解，用濾紙粗濾后，再用玻璃或塑料濾器過濾除菌，分裝入小瓶，4℃保存，同時做無菌試驗陰性后才能使用。
(2)EDTA(乙烯二胺與乙酸或Versene)溶液 EDTA是一種化學螯合劑，毒性小，對貼壁細胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。稱0.1gVersene溶解于500mL無鈣鎂離子磷酸緩沖液中，15磅30分鐘高壓滅菌，4℃或室溫保存。
(3)胰蛋白酶—EDTA的配制 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4mL，無鈣鎂離子緩沖液100mL。
3、抗生素溶液
為防止細胞培養過程中發生污染，一般在培養液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100μg 。配制時取青霉素1×106和鏈霉素1×106μg,溶于100mL Hanks或PBS中，使其含量為青霉素1×104U/mL，鏈霉素1×104μg/mL，使用時每100mL培養液中加入0.5~1mL。
4、0.5%臺盼蘭(Trypan blue)液
稱取臺盼蘭0.5g，溶于100mL磷酸緩沖液中，溶解后濾紙過濾，室溫保存。
5、0.1%結晶紫的配制
稱0.1結晶紫，溶于0.1N的100mL檸檬酸溶液中，(即2.1g檸檬酸加水100mL)， 置37℃溶解24小時，分裝備用。
三、培養基
維持體外培養細胞生存和生長的液相基質，稱細胞培養基或簡稱培養液。理想的培養液必須具備以下條件：
(1)保持正常細胞滲透壓及pH緩沖系統。
(2)必須供給細胞基本營養物，包括細胞合成代謝、能量代謝及微量元素等。
(3)培養液中沒有毒物或抑制細胞生長的物質。
(4)各種基本成分的量合適，互相之間具有平衡關系，能精確定量調整。
(5)容易制成成品，生產簡單，最好能高壓滅菌。
培養基的種類較多，作用略有差別。凡是能供細胞生長繁殖的培養基稱為生長液。若細胞生長快，在生長液中維持時間不長，可從瓶壁脫落下來，或者由于生長密度過大，使顯微鏡觀察困難。為避免此現象的出現，常在細胞成片后改換成維持液，這種維持液可使細胞在數周內處于良好的狀態，特性不變，可隨時供應。此種維持液為無血清或低血清(2%)培養液。如199培養液不加血清就是良好的維持培養基。有時此種培養基中加入明膠或脫脂乳。還有一種由Smith設計的、含有超濾的肝消化物作為維持培養基。
(一)天然培養基(natural medium)
天然培養基主要是取自動物體液或從動物組織分離提取的物質，如血清、雞血漿、雞胚浸出液等。其營養成分豐富，培養細胞有效。最初的體外細胞培養大多用這種培養基。但由于成分復雜，個體差異大，來源有限，又很難標準化，所以實際工作中，往往是天然培養基結合在人工培養基中使用。如血清和水解乳蛋白是使用非常廣泛的天然培養基，市場有現成產品出售，不需自制，可省去許多麻煩。
1、血清
血清是全血凝固后分離上清液而得的制品，其除了含有供給細胞生長所不可缺少的營養成分外，還使細胞合成DNA，提供細胞增殖所必須的生長因子。血清的主要成分為蛋白質、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、銅酸等。
細胞培養最常用的是牛血清，除了其營養價值較其他血清高，還有以下優點：
（1）它的胎盤能阻止母體的免疫球蛋白進入胎牛而沒有抗體等的抑制效應物質。
（2）較易獲得。牛血清共分三類：
①小牛血清(calf serum)，取年齡在6個月，體重達226kg的小牛放血致死而得。
②新生小牛血清(new born calf serum),出生5天內的小牛放血后得。
③胎牛血清(fetal borvine serum)，以無菌手術剖腹后取胎(210～300天胎齡)，穿刺心臟采血制得。
一般市售血清均為混合血清，有成分互補的優點，更適宜于細胞生長。
購置的血清應做熱滅活處理。將小牛血清置于56℃水浴中滅活30分鐘，以破壞補體及一些污染微生物(如病毒、支原體等)，放置4℃冰箱中，無菌試驗陰性。未滅活的血清不穩定，應保存于-20℃冰箱中。
血清雖對細胞生長極為重要，但其成分復雜，作用機制尚未完全了解，加上供血動物的個體差異，其中有些成分對分析細胞生物學反應不利，有的甚至對細胞有害。所以在生長液中血清使用濃度為10%～20%，維持液為2%～3%，有時根據培養目的，甚至需要用無血清培養基。
2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin)
水解乳蛋白也是一種常用的天然培養基。它是乳蛋白經蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，為一種均勻淡黃色或灰黃色粉末，有潮解性，故常密封保存在陰涼干燥處。其水溶液呈弱酸性，不溶于醇或醚。常用濃度為0.2%～5%，用平衡鹽溶液配制。0.4%濃度的水解乳蛋白經分解后幾乎與人血漿中氨基酸成分相當。在此培養基中再加入血清，可培養很多種細胞。市售產品每批都有差別，應先預試。
0.5%水解乳蛋白的配制：稱取0.5g水解乳蛋白粉末，用少許滅菌的Hanks液調成糊狀，再補充Hanks液至100mL，待充分溶解(室溫置1~2h)后，粗濾分裝，以115℃20分鐘高壓蒸汽滅菌，無菌試驗陰性，置4℃冰箱保存備用。
3、酵母浸出液
該液在無血清蛋白存在時可促使細胞增殖。酵母浸出物中有幾種結合蛋白的物質對增加細胞的生長率特別有利。它還含有豐富的維生素，故天然培養基中也常加有酵母浸出物成分，常用濃度為0.1%。
4、雞胚浸出液
雞胚浸出液含有生長因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，可刺激細胞生長增殖，幾乎各種組織細胞培養物都可使用。常用濃度不能超過30%。近幾年，由于培養基的廣泛使用，雞胚浸出液的使用已大為減少。
雞胚浸出液的制備：取孵育10～20天的雞胚，用洗液洗三次后剪碎或攪拌后加入Hanks液并攪均勻，注意氣囊、膜囊和尿囊膜必須剝離去除。置室溫或在37℃下孵育30分鐘或更長時間，并采取凍融方法以助析出浸出液。2000r/min離心沉淀20分鐘，取出上清，作無菌試驗陰性，加雙抗；分裝后低溫保存，也可采用過濾法除菌。
5、雞血漿
雞血漿含有纖維蛋白原和其他一些營養成分，是使用最早的天然培養基。缺點是易于液化，故很少單獨使用。
雞血漿制備：在無菌條件下配制0.2%生理鹽水肝素液，115℃20分鐘高壓滅菌或過濾除菌，分裝入小瓶。取消毒過的干燥注射器先吸少許肝素，濕潤針管內壁，選擇年幼的雞，從翼靜脈采血。3000 r/min 離心10分鐘,分裝入小瓶,于-20℃冰箱保存備用。
6、胰酶消化牛心肌浸液
該浸液主要用作支原體檢查。制備方法如下：
（1）新鮮牛心用蒸餾水洗兩次，切開除去內膜、脂肪及結締組織等，用絞肉機將心肌絞碎，稱取250g加雙蒸水900mL，加NaCl 5g，放入三角燒瓶內。
（2）56℃水溶加溫10～20分鐘，再加入胰酶2.5g，待胰酶全部溶解后用NaoH調節pH至8.0，以增強消化能力，于56℃消化2小時，并不斷攪拌，保持pH8.0左右。
（3）將心肌消化懸液用HCl調至pH6.0左右，煮沸5-10分鐘，再用四層紗布濾去肉渣，略加壓力將肉汁擠出，將浸出液加雙蒸水至1000mL。
（4）加酵母浸膏1g攪拌之，調pH至8.0再煮5分鐘，四層紗布（中間墊一層脫脂棉）過濾，再用cp濾紙過濾，pH保持在8.0，即成牛的心肌浸液，115℃15分鐘高壓滅菌，置4℃冰箱保存備用。
(二)人工合成培養基
天然培養基的來源是有限的，要進行大量體外細胞培養，需要選用人工合成的各種化學物質配制而成的、又利于細胞生長的培養基。1950年，Morgan提出了包括69種成分的199配方，開始了人工合成培養基的歷史，它是在平衡鹽溶液中加入標準的化學營養物質而構成的培養基。隨著生物化學的飛躍發展，人們不斷應用生化提純或人工合成的各種化學物質設計出許多種合成培養基的配方，企圖找到最有利于組織細胞生長的培養液，如199，Eagle 、RPMI1640、HAMF12、NCT109等。
1、人工合成培養基的優點
人工合成培養基具有以下優點：
（1）人工培養基是用已知成分配制，培養條件一致。
（2）它可以精密地測定培養的細胞與培養液內物質變化的情況，用生化定量的方法可以分析各種組織以及各種實驗條件下不同組織細胞的生長和代謝，這也可提供和篩選更加有利于細胞生長的更趨簡化的培養基。
（3）用人工培養液培養的細胞比較透明清楚，胞漿內的顆粒很少，換液時間可適當延長，從而節省人力、物力。
（4）人工合成培養基克服了天然培養基中可能潛在病毒污染的缺點，有利于培養和研究病毒。
（5）培養基成分便于儲存和大量配制，便于細胞大量生產。
2、人工合成培養基的成分
人工合成培養基的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些輔助物質。這些營養物質的主要作用見前一章。
隨著科學技術的進步和細胞培養技術的發展，人工合成培養基不僅品種增加，配方相對固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培養基成分趨于簡單化。現今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培養液比以前已有了較大改進，增減了一些成分，以滿足細胞培養中新技術的需要。如雜交瘤技術中常用的DMEM培養基，使用時需補加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促進分裂原的反應和DNA合成，增加細胞轉化。2-Me常配制成0.1mol/L的貯存液，用時每升培養液加0.5mL。PHA有市售的商品。
3、幾種常用人工合成培養基的配制
(1)RPMI1640培養液 稱10.4g粉末(市售進口產品一般為一包)，溶于1000mL三蒸水中，待溶解后通入CO2約5分鐘，至液體呈檸檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺，或先用1 N HCl調至pH6.8以下，后用1 N NaOH調至pH7.2～pH7.4；用無菌玻璃濾器或金屬濾器0.22μm或0.3μm微孔濾膜過濾除菌，按所需量分裝,置低溫保存。
(2)Eagle基礎培養基 稱9.4g粉末(一小包)加入1000mL三蒸水中，待完全溶解后采用121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘，臨用前按比例加入谷氨酰胺，并用10%NaHCO312.5mL～22mL(或通入CO2)，調pH7.２～pH7.4，過濾除菌，低溫保存。
(3)生長培養液 根據各種細胞培養的需要，在配制人工合成培養基時，尚需加入一定量的天然合成培養液，構成最適合細胞生長的培養液，加入適量血清的生長液就是其中的一種。這種培養液主要為細胞生長增殖之用，所含血清比例較大。一般配法：基本培養基80%～90%，小牛血清10%～20%，并加雙抗生素(青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/ml)，上述比例如有特定需要，可根據細胞培養要求進行增減。
(4)維持液 這也是在基礎培養基上配制的細胞培養用液，主要作用是維持細胞緩慢生長而不死。一般血清含量較少，通常基本培養基為97%～98%，小牛血清3%～2%。
(5)無血清培養基 因血清所含成分復雜，同時也含有一些不可控因素，細胞毒性物質和抑制物，不僅影響細胞生長和細胞某些功能的表達，有的還會對細胞產生去分化作用，影響一些基礎醫學研究的結果。因此，一些技術要求和研究目的較高的細胞培養，如細胞生長因子研究和制備、單克隆抗體制備、細胞分泌產物的研究和制備等，都須用無血清培養基，以減少或去除異種蛋白及干擾因素。不僅對產品純化提取有益，而且可避免異種血清所引起的過敏反應。
無血清培養基主要有基礎培養基和輔加成分組成，基礎培養基一般用人工合成培養基，最常用的是HamF12和DMEM培養基1:1混合。然后補加15mmol/L Hepes1.2g/mL，NaHCO3作為基礎溶液。輔加成分有：
①促貼壁附著成分，如 纖維粘連蛋白，層粘連蛋白膠原等。
②促生長增殖成分，如 一些生長因子和激素。
③蛋白酶抑制物，如 大豆胰蛋白酶抑制劑（Soybean trypsin inhibitor）。
這些輔加成分根據細胞生長條件和實驗要求添加。一般先配好儲存液，過濾除菌，低溫保存，要避免反復凍融。使用濃度和使用方法各不相同。如纖維粘連蛋白的配制濃度為25mg～50mg/L，用時先涂在培養瓶皿支持物上；層粘連蛋白1mg～5mg/L，可直接加在培養液中。成纖維細胞生長因子配制濃度2mg/L，使用濃度5μg /L，可直接加入培養液中；大豆胰蛋白酶抑制劑，使用濃度為0.1%～0.5%，通常配制在基礎培養液中。
