一、背景
破傷風( tetanus) 是破傷風桿菌侵入人體傷口后，在局部生長繁殖并產生外毒素所致的急性疾病。近年來隨著毒品成癮者越來越多采用注射方式吸毒，且其使用的注射針具可能被多種細菌污染，乃至因靜脈吸毒者發生破傷風逐年增加，在某些經濟發達和吸毒高發地區，甚至已成為破傷風的主要傳播途徑。破傷風是一種完全可預防的疾病，由于發展中國家的免疫不普及，大部分病例發生在發展中國家，且由于缺乏有效的治療方法，破傷風仍是一種高死亡率的疾病，死亡率為 20 %～ 30%，重癥患者的死亡率可 高達70 %。而如美國等發達國家中亦有較高的發病率。
因此，破傷風仍是一種嚴重危害人類健康的疾病。破傷風桿菌在自然界中分布極為廣泛，很多家畜糞便中都帶有破傷風桿菌，人糞中也常帶菌。細菌的芽胞常存在于土壤，污泥和塵埃中。不同類型和大小的傷口均可成為破傷風桿菌的入侵門戶。
破傷風梭狀芽胞桿菌 ( Clostridium tetani，簡稱為破傷風桿菌) 是一種革蘭陽性厭氧芽胞桿菌，是破傷風( Tetanus) 的病原菌。它侵入傷口內繁殖、分泌內毒素且引起急性的特異性感染，主要表現為全身或局部肌肉的持續性收縮和陣發性痙攣。1962 年，Latham 開發出了適合破傷風芽胞桿菌生長的半合成培養基，此培養基含有胰酶消化酪蛋白，至今仍廣泛使用。
二、致病性
破傷風桿菌能產生兩種在氨基酸結構上基本相似的外毒素，即 溶血 毒素 ( Hemotoxin)和破傷風痙攣毒素( tetanospasmin)。溶血毒素在功能和抗原性與鏈球菌溶血毒類 O 相似，目前此毒素在破傷風致病中的作用尚未明確。破傷風痙攣毒素是一種蛋白質，不耐熱，56 30min即可被破壞。可被腸道中存在的蛋白酶所降解，故口服該毒素無致病作用。
痙攣毒素在菌體內合成時是一條多肽鏈，分子量 160KDa，可在蛋白水解酶作用下裂解成一條輕鏈(分子量為 55KDa)和 一條重鏈 (分子量為105KDa)，兩條肽鏈分開后，各部分的血清學特性仍存在，但其毒性消失，重新聯合時又恢復其毒性。重鏈是毒素與神經細胞表面的神經節苷酯結合部位，輕鏈則具有毒性作用，但必須與重鏈聯合方能致病。破傷風痙攣毒素是由一個大質粒編碼，整個毒素基因有 3945 核苷酸，編碼 1315 的氨基酸，其中有一段約 20 個氨基酸部分無毒性作用，是刺激人類 T 細胞增殖的決定簇。
破傷風的發病機制是破傷風桿菌芽胞進入缺氧的創口后，在局部發芽繁殖產生痙攣毒素，此毒素通過外周神經纖維間隙，或通過血液，淋巴液等途徑到達中樞神經系統，毒素通過重鏈與脊髓及腦干組織細胞表面的神經節苷脂結合并進入細胞，通過輕鏈的毒性作用抑制突觸未端釋放神經介質，抑制了正常的調節功能，產生特有的破傷風臨床表現。
三、培養
傳統的破傷風桿菌產毒培養基，一般含肉類(乳牛心浸液 BHI) 或乳類( 酪蛋白消化液中的 N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR) 制品，其他還有葡萄糖、氨基酸、維生素、尿嘧啶和無機鹽等。已經明，N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR對細菌生長是必需的。目前使用的干酪素胰酶消化液(胰酪消化液)和胃酶牛肉消化液(濃胨水) 是作為破傷風桿菌產毒培養基氮源的主要原材料，但是隨著生產規模的擴大，制作一批基礎液已經不能保證生產的連續多批次使用。為解決上述問題，從 2008 年開始將破傷風桿菌產毒培養基的主要原材料胰酪消化液、濃胨水、豬肝水透析外液用商品化的類似原材料代替。
先保持胰酪消化液、濃胨水和其他組分不變，嘗試應用肝浸粉替代豬肝水透析外液，并從培養基制備量小( 60 L)逐步擴大到制備量為 120 L、300 L、700 L 各 6 批，通過生化檢測和破傷風桿菌產毒水平試驗，同時用豬肝水透析外液的培養基接種破傷風桿菌的產毒水平進行對比，其結果顯示差異無統計學意義。因此，用肝浸粉可以替代豬肝水透析外液。
接著嘗試應用胰酪胨替代胰酪消化液制備破傷風桿菌產毒培養基 11 批，試驗產量為 18L，同時以胰酪消化液和濃胨水為基礎液的培養基 540 L，對其生化指標質量控制和接種破傷風桿菌的產毒情況進行了比較： 2009 年，用胰酪胨和不同的月示胨作試驗培養基，同時用胰酪消化液和濃胨水為基礎液的培養基 540～670 L，對質量控制生化指標和細菌產毒情況進行了對比，選擇出一種可用的月示胨以替代原來的濃胨水。
2010 年上半年菌種用培養基沿用傳統的原材料配制，試驗選用胰酪胨和月示胨制備破傷風桿菌產毒培養基制備量 54 L 30 批次，同時使用胰酪消化液和濃胨水為基礎液進行質量控制和破傷風桿菌產毒水平對比： 2010 年下半年菌種用培養基選用胰酪胨和月示胨，試驗選用胰酪胨和月示胨制備破傷風桿菌產毒培養基，制備量依次為 36、72、500和 520 L 各 3 批次逐漸擴大，檢測培養基的質量控制生化指標和產毒情況進行試驗，完成從小量到大量的原材料替代試驗。
而 2012 年，選用的胰酪胨和月示胨替代傳統自制的胰酪消化液和濃胨水制備破傷風桿菌產毒培養基，大罐制備量為 500 L 共 48 批次，其培養基檢測的各項生化指標穩定，產毒能力良好，表明肝浸粉、胰酪胨和月示胨替代傳統原材料制備的培養基易于生化指標的質量控制，可適用于破傷風桿菌產毒規模化的生產。
四、抗菌方法
有實驗構建和純化抗破傷風桿菌信息菌素（pH-CT），并初步檢測其抗菌活性。從分泌針對破傷風桿菌表面抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞中擴增出抗體可變區基因序列，利用雙聯寡核苷酸點突變技術將抗體模擬物與大腸菌素融合構建pH-CT，經離子交換柱純化后，通過菌落培養加入不同劑量信息菌素pH-CT（ 終濃度2、4、8、16μg/mL），觀察pH-CT 的體外抗菌活性。通過培養液中接種破傷 風桿菌，并加入不同劑量的pH-CT（ 終濃度4、16μg/mL），厭氧培養16h后取濾液及菌液行小鼠腹腔注射，觀察pH-CT 的體內抗菌活性。
結果成功構建抗破傷風桿菌pH-CT。體外實驗結果顯示，涂布加入pH-CT2、4μg/mL 孵育菌液的固體培養基上仍見破傷風菌落生長，而涂布加入pH-CT8、16μg/mL 孵育菌液的培養基上均無菌落生長；體內實驗結果顯示，濾液和菌液組中對照組小鼠1d內均全部死亡，濾液組pH-CT4、16μg/mL 組小鼠3d內全部存活，菌液組中pH-CT４μg/mL組小鼠3d內存活3只（50％），pH-CT16μg/mL 組小鼠3d內全部存活。因此構建的pH-CT在體內和體外都表現出對破傷風桿菌有抗菌活性，為臨床治療破傷風提供了新思路和新途徑，具有應用于臨床的潛在價值。
