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培養細胞的常規檢查和觀察方法

 細胞在體外培養過程中需要每天進行常規檢查和顯微鏡觀察,及時了解細胞生長狀態、數量改變、細胞形態、細胞有無移動、有無污染、培養液pH是否變酸、變黃是否更換等。細胞常規檢查觀察的內容為:
一、肉眼觀察
一般常規檢查用肉眼即可觀察,主要看培養液的顏色和透明度的變化。正常情況下,培養液pH介于7.27.4之間,呈桃紅色清亮透明。加入細胞在培養瓶中置一般溫箱培養時,隨著細胞生長時間的延長,細胞代謝產生的酸性產物會使培養液pH值下降,引起顏色變淺變黃。在超越緩沖范圍后培養液酸化變黃,如不及時調節pH,會影響細胞的生長,甚至造成細胞退變死亡。所以,一旦發現培養液變黃,應及時換液傳代。一般更換培養液的時間,依營養物的消耗而定,正常情況生長穩定的細胞23天換液一次,生長緩慢的細胞34天換液一次。培養液中加Hepes或用5%CO2溫箱培養可使pH維持穩定,利于細胞生長。用含磷酸鹽緩沖系統培養時,可因瓶及塞子漏氣,CO2溢出,也可能由于培養瓶塞洗刷不潔、殘留堿性物,使培養液變堿發紅,只致使細胞難以生長,甚至死亡。細胞換液傳代后,若發現培養液很快變黃,要注意是否有細菌污染或培養器皿沒有洗干凈。貼壁細胞培養時若出現混濁,多為污染。懸浮培養的細胞,應將瓶豎起靜置1小時,若培養基混濁示為污染,也可在顯微鏡下仔細觀察有無污染現象出現。
二、顯微鏡觀察
生長良好的細胞,在顯微鏡下可觀察到細胞透明度大,折光性強,輪廓不清。相差顯微鏡觀察時可見細胞部分細微結構。若細胞生長狀態不良,可見細胞輪廓增強,細胞折光性變弱,細胞胞質中出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物質,細胞之間空隙增大,細胞形態不規則,甚至失去原有細胞的特點,產生圓縮脫落,有時細胞表面及周圍出現絲絮狀物。若細胞營養不良狀況沒有得到及時糾正,進一步發展可見到部分細胞死亡,崩解漂浮在培養液中。發現這種情況應及時處理,只有生長良好的細胞才能進行傳代培養和實驗研究。
三、細胞的生長狀態
細胞培養時,經初代培養或傳代培養,都有一長短不同的潛伏期,在培養過程中注意觀察細胞增殖生長的狀態極為重要。各種細胞增殖的時間不盡一致。傳代細胞系,胚胎組織或幼體細胞潛伏期短,一般在接種培養第二天即可見細胞生長增殖,34天便可連接成片。成體組織的潛伏期長,老年組織和癌組織潛伏期更長,可達一周左右。原代細胞培養中最先可見從組織塊中邊緣“長出”細胞,這種細胞是從原代組織塊中游走出來的,并不是細胞增殖產生。這種早期游出的細胞多以成纖維細胞為主,其易生長,適應性強,呈放射狀或旋渦狀分布,很快生長并互相連接成網狀。傳代細胞在傳代后,一般經過懸浮、貼壁伸展很快進入潛伏期,對數生長期,細胞大量繁殖,逐漸相連成片而長滿瓶底。一旦發現細胞長滿瓶底80%就應及時傳代,否則會影響細胞生長甚至脫落。懸浮細胞當發現生長顯著、密度增大、分布稠密、培養液變黃時也應及時傳代。
四、微生物污染
細胞接種、傳代、換液加藥后應經常觀察,密切注意是否有微生物污染發生。一旦發現培養液混濁、液體內漂浮著菌絲或細菌,或生長明顯變緩,胞質內顆粒增多,有中毒表現等應懷疑是否有微生物污染,進一步觀察檢查并及時處理。
 
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