1) 當細胞匯合度達到 85%以上時，可進行凍存。

2) 在生物安全柜內，打開培養瓶瓶口，收集瓶內的培養基；

3) 向培養瓶內加入3ml無菌的 1×PBS 后，水平放置培養瓶，使PBS能夠浸潤到培養瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS；

4) 向瓶內加入消化液1ml，浸潤底面后放入 37℃ CO2 培養箱中孵育 1~2min；

5) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓飄起，若全部消化下來則直接向培養瓶內加入

注：如還有部分細胞未消化下來，可采用分步消化：2ml 含10%FBS 的培養基（這里的培養基可以用DMEM就行或者其他的基礎培養基）中，將懸液吸入15ml 離心管；

① 準備一個無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的培養基；

② 將消化下來的細胞吸入①中的離心管內中和（避免吹打）；

③ 向之前消化的培養瓶中加入 1ml 胰酶繼續消化 2min 左右，輕拍培養瓶，95%左右細胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養基中和，中和后的細胞懸液移入①中的離心管內。

6) 1000rpm 離心 5min；

7） 離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細胞沉淀，然后轉入 1.8ml 凍存管中；

8） 將凍存管轉入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉入-80℃冰箱中過夜降溫；

9） 第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉入液氮罐中保存。