報(bào)告基因（Reporter Gene）：通常指可編碼某種蛋白或酶，其表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測(cè)，并且能與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因，通過它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。
熒光素酶報(bào)告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)；
一、原理簡(jiǎn)述
（1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。
二、技術(shù)流程
（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2）設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。
（3）篩選陽性克隆，測(cè)序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照，提純備用。
（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長(zhǎng)10-24小時(shí)（80%匯合度）。
（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測(cè)。
（9） 計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并與空載對(duì)照比較。
綠色熒光蛋白的發(fā)光原理
GFP的第65至67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時(shí)，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導(dǎo)致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應(yīng)。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團(tuán)可進(jìn)一步發(fā)生氧化脫氫，最終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對(duì)第65位絲氨酸的羧基進(jìn)行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合，并最終自發(fā)催化形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。
GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剑坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵校珿FP熒光便立即得到恢復(fù)。一般來說弱還原劑并不會(huì)影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對(duì)GFP熒光影響也不大。
綠色熒光蛋白的發(fā)光特性
GFP吸收的光譜最大峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜最大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。
