1. 原理
1.1. 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
1.2. 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber 中細(xì)刻9 個(gè)1 mm2 大正方形，其中4 個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16 個(gè)小格，深度均為0.1 mm。 當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，
乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。
1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。 一般使用藍(lán)色之trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。
2. 材料
2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.2. Erythosin bluish stain
取0.1g Erythrosin bluish (Sigma E-9259)及0.05g preservative methyl paraben(Sigma H-3647)溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
2.3. 血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)
2.4. 計(jì)數(shù)器(counter)
2.5. 低倍倒立顯微鏡
2.6. 粒子計(jì)數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步驟
3.1. 取50ml 細(xì)胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色- Erythrosin bluish)。
3.3. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以104， 即為每ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。 4大格細(xì)胞總數(shù)×2×104/4 = 細(xì)胞數(shù)/ml
*每一大格的體積= 0.1cm × 0.1cm × 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球計(jì)數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。
3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤， 計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59
死細(xì)胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6
細(xì)胞總數(shù)= 243
平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75
稀釋倍數(shù)= 2
細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細(xì)胞數(shù)/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
